[實驗原理]
基因工程誕生于1973年.在這一年.斯坦福大學(xué)的S.Cohen等人將大腸桿菌的抗四環(huán)素質(zhì)粒PSC101和抗新霉素及磺胺的質(zhì)粒R6-3在體外用EcoRI進行切割,并把他們連接在一起形成一新的重組質(zhì)粒：然后,將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中.結(jié)果,在含有四環(huán)素和新霉素和新霉素的平皿中,篩選出了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落.這是第一次實現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化成功的例子,基因工程從此誕生.目前,基因工程已成為分子生物學(xué)的一個重要領(lǐng)域,但對其還沒有一個統(tǒng)一的公認定義.一般認為基因工程是指：在體外,將核酸分之（無論采取什么方法從細胞中取得）組合到任何病毒、細菌質(zhì)粒或其它載體系統(tǒng)（分子）中,形成遺傳物質(zhì)的新組合,并使之進入原來沒有這類分子的宿主體內(nèi),而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖.基因工程的最大特點使以重組DNA技術(shù)開辟了在短時間內(nèi)改造生物遺傳性狀的新天地.
基因工程的研究內(nèi)容如下：
1． 目的基因的獲取 .
2． 克隆載體的選擇與改建.
3． 目的基因與載體的連接.
4． 重組DNA導(dǎo)入受體細胞.
5． 重組體的篩選.
6． 設(shè)法使目的基因?qū)崿F(xiàn)功能蛋白的表達.
基因工程的重要環(huán)節(jié)就是如何把外源基因?qū)氲绞荏w細胞中去.外源基因自己很難進入受體細胞中,既是進入受體細胞中,一般也不能進入復(fù)制和表達.這是因為我們得到的目的基因不帶有復(fù)制子系統(tǒng)和表達調(diào)空系統(tǒng),所以我們必須利用運載工具即載體將外源基因?qū)氲绞荏w細胞中去.
質(zhì)粒就是一種最常用的載體.他是染色體以外的能自主復(fù)制的雙蓮、閉合、環(huán)狀DNA分子.廣泛存在于細胞中,在一些動、植物細胞中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在.作為載體的質(zhì)粒必須具備以下六個特點：（1）能自主復(fù)制：（2）具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點,并在位點中插入外源基因后,不影響其復(fù)制功能：（3）具有1-2個篩選標(biāo)記：（4）分子量小,多拷貝,易于操作：（5）是非結(jié)合性質(zhì)粒即不含有結(jié)合轉(zhuǎn)移基因,在自然條件下不能從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞中去：（6）轉(zhuǎn)化效率高.
本次實驗是從大腸桿菌中提取和純化質(zhì)粒,以備進一步研究之用,其原來如下：
從大腸桿菌中提取和純化質(zhì)粒的方法很多,但不外乎三個主要步驟即細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質(zhì)粒的分離和純化.
1． 細菌的培養(yǎng)
挑單個菌落接種到適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng).通常以細菌培養(yǎng)夜的O.D600nm值來判斷細菌的生長狀況,一般情況下,O.D600nm=0.4時,細菌處于對數(shù)生長期：O.D600nm=0.6時細菌處于對數(shù)生長后期.由于質(zhì)粒在細菌內(nèi)進行復(fù)制時,往往受到宿主的控制,因此在對數(shù)生長后期可進入氯霉素.氯霉素可抑制細菌的蛋白質(zhì)生物合成和染色體DNA的復(fù)制,而質(zhì)粒的復(fù)制不受其影響而得以大量擴增.對于新一代的質(zhì)粒如pUC質(zhì)粒系列,由于宿主對其復(fù)制控制不嚴,所以添加氯霉素已不十分必要.使用氯霉素的目的是,在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下,減少細菌的培養(yǎng)體積和數(shù)量以降低細菌裂解物的復(fù)雜性和粘稠度.
2． 細菌的收集和裂解
細菌在生長過程中,會將大量代謝物排到培養(yǎng)液中.為提高質(zhì)粒的純度,往往通過離心棄除培養(yǎng)液,在將細菌沉淀適當(dāng)干燥或用緩沖液漂洗1~2次,以便盡量將培養(yǎng)液去除干凈.
裂解細菌的方法很多,如SDS法、裂解法、煮沸法等.它們各有利弊,應(yīng)根據(jù)所提質(zhì)粒的性質(zhì)、宿主菌的特性及純化質(zhì)粒的方法等因素加以選擇.
本實驗采用堿裂解法.首先破壞細菌的細胞壁：再用SDS使細胞膜崩解,與此同時用NaOH提高溶液的pH值,使染色體DNA、蛋白質(zhì)及質(zhì)粒均變性.
3． 質(zhì)粒的分離和純化
往第二步溶液中加入酸性溶液使裂解液的pH值恢復(fù)到中性,此時,質(zhì)?？蓮?fù)性并恢復(fù)原型,而染色體DNA仍處于變性狀態(tài).經(jīng)離心,染色體DNA與細胞碎片一起沉淀.然后,再用酚、氯仿等蛋白質(zhì)變性劑去除蛋白質(zhì),用Rnase去除RNA,即可得到質(zhì)粒的粗制品.以后,可用超離心法、電泳法、離子交換層析法或排組層析法等進一步純化質(zhì)粒.
[儀器與消耗]
1.儀器：YXQ-SG41-280型電熱手提高壓鍋、HZ-C恒溫空氣震蕩器、TG-13W微量高速離心機、WH-861型旋渦混勻器、SIN-F123顆粒型制冰機、SC-326冰箱、可調(diào)式移液器.
2.耗材：含有重組質(zhì)粒（pUC18/GAPDH）的菌株（HB101）Eppendorf管、吸
[步驟]
1.酶切：20μl酶切體系（按下表加試劑）
質(zhì)粒DNA 10╳酶緩沖液 EcoRI(15u/μL) BamHI(15u/μl) 雙蒸水
實驗組1 6μL 2μL 1μL 1μL 10μL
實驗組2 6μL 2μL 1μL 11μL
對照組 6μL 2μL — -- 12μL
混勻,37℃水浴1-2小時.
2.向上述個反應(yīng)管中,分別加入4μL 6×上樣緩沖液.
3.電泳：
① 將1%濃度的瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml EB）鋪于水平電泳槽上,并插上梳子.
② 待凝膠凝固,將梳子拔出.往電泳槽中注入0.5×TEB緩沖液,直至剛沒過凝膠.
③ 按以下順序上樣：
1道 2道 3道 4道
DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker） 對照組樣品（未酶切質(zhì)粒） 實驗組1樣品 實驗組2樣品
④將加樣一端接上負極,另一端接上正極,電場強度5V/cm,待溴酚藍移動到接近正極一端停止電泳.
⑤將凝膠移至黑暗處,用紫外燈觀察電泳結(jié)果.
[試劑]
1. EcoRI（15u/μL）
2. BamH I（15u/μL）
3. 5×TBE（pH8.3電泳緩沖液）Tris 5.4g
硼酸 2.25g
EDTA 0.46g
ddH2O2定容至 100ml
4. 1%瓊脂糖：瓊脂糖1g,0.5×TBE100ml.
5. 6×上樣緩沖液：50%甘油,1×TBE,0.5%溴酚藍 ,0.5%二甲苯青
6. 溴化乙錠（EB）：0.5mg/ml
質(zhì)粒DNA
掃我聯(lián)系